Human cord blood CXCR5+ CD4 T cells: association with in utero exposure and antibody response to Plasmodium falciparum.

Lionel Neba AMBE (lionelambe@yahoo.com)
Department of microbiology, parasitology, haematology and immunology, Faculty of Medicine and Biomedical Science-University of Yaoundé 1
June, 2015
 

Abstract

Introduction:
In malaria-endemic regions such as sub-Saharan Africa, foetuses may be exposed in utero to malaria parasite products from their infected mothers. Though the foetus has long been considered to be immunologically hypo-responsive to in utero aggression, recent studies have shown the contrary. Functional T and B cells have been identified in the human foetus as early as the 12th week of gestation. Cytokines and immunoglobulins have also been found to be produced by cord blood T and B cells respectively, in response to Plasmodium falciparum (Pf) exposure. Whether or not these responses are specific or could lead to the generation of long-term immune memory and long-lived plasma cells that produce high affinity antibodies is not well known. However, T follicular helper cells located in the germinal centre help B cells to differentiate into plasma cells and memory B cells. The foetus not having matured lymphoid follicles is thus not capable of producing these cells. Recently, CXCR5-positive (CXCR5+) CD4 T cells, also called circulatory T-follicular helper cells (cTFH), have been identified in adult peripheral blood to help B cells in antibody production. This raises the question on whether cTFH cells are also produced in utero and are involved in prenatal antibody responses.
Objective
With this in mind, we carried out a research study aimed at determining if CXCR5+ CD4 T cells are present in umbilical cord blood and if they are associated with in utero exposure and antibody responses to Pf antigens.
Methods:
To attain our objectives, we designed a cross-sectional study involving pregnant women at delivery and their new-born babies from the Yaoundé Central Hospital and maternities in Nkolbisson Health District. HIV positive women and women who delivered by Caesarean Section or who refused to participate were excluded. Blood was collected at delivery from the umbilical cord and intervillous space (IVS) of the placenta of women who had active malaria confirmed by RDT or a history of malaria from the twenty secondth week of pregnancy. Blood smear microscopy and nested polymerase chain reaction (PCR) were used for malaria diagnosis and speciation. The MagPix Multiplex Analyte Platform (MAP) assay was used to quantify IgM and IgG, to the malarial antigens AMA1, EBA175 and MSP1, in cord blood plasma and in cord blood mononuclear cell (CBMC) culture supernatants respectively. Real-Time quantitative PCR was used to quantify CXCR5 gene expression in CD4+T cells isolated from CBMC. Data were analyzed using GraphPad Prism 5.0. The study was approved by the Cameroon National Ethics Committee for Research on Humans and we submitted our research protocol to the Ethics Committee of the Faculty of Medicine and Biomedical Sciences, University of Yaoundé 1.
Results:
A total of 30 paired maternal and cord blood (CB) samples and 6 control non-pregnant adult peripheral blood samples were used. 20% of the women were placental malaria-positive by microscopy with parasites detected in IVS blood and/or placental impression smears. However, 40% of the women were positive for P. falciparum by PCR. No parasites were detected by microscopy in CB smears, but 16.7% were positive for malaria by PCR. None of the cord blood plasma tested positive for antimalarial IgM, while 16.7% of the CBMC culture supernatants tested positive for antimalarial IgG to all three malarial antigens.
We detected CXCR5 expression in CD4 T cells in 66.7% of the CB samples with 20% having CXCR5 expression levels greater than the least expressing adult sample and 3.3% having expression levels comparable to the median expression of all adult samples. The CXCR5 relative gene expression was significantly higher in neonates born to mothers with placenta malaria (p=0.016) and treatment of cultured CBMC with 10µg/mL of MSP-1 antigen, increased CXCR5 gene expression (compared to expression in paired untreated CBMC) in 55% of the CB samples. The expression of CXCR5 in CB CD4 T cells did not correlate with anti-malarial IgG titres in CBMC culture supernatant.
Conclusion:
We concluded as follows: CXCR5+ CD4 T cells are produced in utero and are detectable in cord blood; The abundance of CXCR5-expressing cord blood CD4 T cells was significantly associated with placental malaria; A direct link was not found between CXCR5 expression in cord blood and in utero anti-malarial antibodies in our study population. From these, we do recommend the following: To further evaluate and characterize circulating TFH in cord blood using accessory but supplementary markers of TFH such as PD-1, BCL6, ICOS and CD45RO; Employ complementary techniques such as Flow Cytometry to enumerate CXCR5+ CD4 T cells in cord blood; Carry out a longitudinal study to determine if high CXCR5 expression in cord blood CD4 T cells at birth influences the acquisition of immunity to malaria during childhood.

Introduction : Dans les régions endémiques de paludisme telles que l’Afrique Sub-saharienne, les fœtus pourraient être exposés in utéro aux particules parasitaires à partir des mères infectées. Bien que le fœtus ait longtemps été considéré comme étant immunologiquement hypo-réacteur aux agressions in utéro, des études récentes ont démontré le contraire. Des cellules T et B fonctionnelles ont été retrouvées chez le fœtus humain dès la 12ème semaine d’âge gestationnel. Il a également été prouvé que des cytokines et des immunoglobulines sont produites respectivement par les cellules T et B du sang du cordon, en réponse à une exposition au Plasmodium falciparum(Pf). La spécificité de ces réponses, la production d’une mémoire immunitaire à long terme et la production d’anticorps à haute affinité par des plasmocytes durables, ne sont pas bien maîtrisées. Les cellules T-auxiliaires folliculaires (TFH) localisées dans le centre germinal sont impliquées dans la production des anticorps par les cellules B. Le fœtus n’ayant pas de centre germinal bien formé n’est pas capable de produire ces cellules. Cependant, il est connu que les cellules T CD4 CXCR5 positives (CXCR5+) aussi appelées cellules T-auxiliaires folliculaires circulantes (cTFH) sont indispensables dans la différenciation des cellules B en plasmocytes et en cellules B mémoires. Ceci suscite la question de savoir si les cellules cTFH sont produites in utéro et impliquées dans la réponse humorale intra-utérine.
Objectif : C’est dans cette optique que notre étude avait pour objectif principal de déterminer si les cellules T CD4 CXCR5+ sont présentes dans le sang du cordon, et si elles sont associées à une exposition in utéro ainsi qu’à une réponse humorale aux antigènes du Pf.
Méthodologie : Afin d’atteindre ces objectifs, nous avons réalisé une étude transversale analytique impliquant les femmes lors de l’accouchement ainsi que leurs nouveau-nés à l’Hôpital Central de Yaoundé. Nous avons exclus les femmes séropositives au VIH, les femmes ayant accouché par césarienne et les femmes ayant refusé de participer à l’étude. Au moment de l’accouchement, le sang a été prélevé du cordon ombilical et de l’espace inter-villeux du placenta des femmes avec TDR positif ou un antécédent de paludisme dès la vingt-deuxième semaine de grossesse. L’examen microscopique et la PCR nichée ont été utilisés comme référence pour le diagnostic du paludisme et l’identification de l’espèce. La technologie MagPix MAP a été utilisée pour quantifier les IgM et les IgG dirigés contre les antigènes palustres AMA1, EBA175, MSP1, respectivement dans le plasma du cordon et dans le surnageant des cultures des cellules mononuclées du sang du cordon (CMSC). La PCR en temps réel a été utilisée pour quantifier l’expression génétique du CXCR5 dans les cellules T CD4+ isolées des CMSC. Les données ont été analysées en utilisant le logiciel GraphPad Prism 5.0. L’étude a été approuvée par le Comité National d’Ethique et de Recherche Humaine et nous avons soumis notre protocole de recherche au Comité Institutionnel d’Ethique et de Recherche de la Faculté de Médecine et des Sciences Biomédicales de l’Université de Yaoundé I.
Résultats : Nous avons utilisé 30 échantillons de sang maternel et de sang du cordon ombilical (SC) ; le sang périphérique de 6 témoins n’étant pas enceintes a été également utilisé. 20% des femmes étaient positive pour le paludisme placentaire par microscopie, avec détection des parasites dans le sang intervilleux et/ou la lame d’impression. Cependant, 40% des femmes étaient positives pour le P. falciparum par PCR. Aucun parasite n’a été détecté par microscopie sur les lames du SC, mais 16,7% étaient positives au paludisme par PCR. Aucun des plasmas du SC ne s’est révélé positif pour les IgM anti-palustres, tandis que 16,7% des surnageants de culture des CMSC étaient positifs pour les IgG anti-palustres pour tous les trois antigènes. Nous avons détecté la présence des cellules T CD4+ exprimant le CXCR5 dans 66.7% des SC avec 20% ayant des taux de CXCR5 supérieurs au taux minimal de CXCR5 adulte et 3.3% ayant des taux de CXCR5 comparables à l’expression médiane des échantillons adultes. L’expression génétique relative de CXCR5 était significativement plus élevée chez les nouveau-nés issus de mère ayant le paludisme placentaire (p=0.016), et l’administration de 10µg/mL de l’antigène MSP-1 au CMSC cultivées a augmenté l’expression de CXCR5 (par rapport aux CMSC pairs non-traités) dans 55% des échantillons du SC. L’expression de CXCR5 dans les cellules T CD4+ du SC ne corrélait pas avec le taux d’IgG anti-palustre dans le surnageant des CMSC.
Conclusion : Nous concluons que les cellules T CD4+ CXCR5 sont produites in utéro et sont détectables dans le sang du cordon ; l’abondance des cellules T CD4+ exprimant le CXCR5 dans le sang du cordon est significativement associée au paludisme placentaire. Enfin, aucun lien direct entre l’expression de CXCR5 dans le sang du cordon et les anticorps anti-palustres in utéro n’a été retrouvé dans notre population d’étude. Fort de ces conclusions, nous recommandons : d’évaluer davantage les TFH circulantes et les caractériser dans le sang du cordon en employant des marqueurs accessoires mais supplémentaires tels que PD-1, BCL6, ICOS et CD45RO ; d’employer des techniques complémentaires tels que la cytométrie en flux pour énumérer les cellules T CD4 CXCR5+ dans le sang du cordon ; et d’effectuer une étude longitudinale afin de déterminer si une expression élevée de CXCR5 parmi les cellules T CD4 du sang du cordon à la naissance influence l’acquisition de l’immunité contre le paludisme pendant l’enfance.


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