Circulating T-follicular helper cells as correlates of high affinity antibody response against Plasmodium falciparum in malaria-experienced Cameroonian adults

Joseph Nelson SIEWE FODJO (jsieweking@gmail.com)
Department of Hematology, Microbiology, Parasitology, Immunology, and Infectious diseases, Faculty of Medicine and Biomedical Sciences - University of Yaounde 1
June, 2015
 

Abstract

Malaria remains a major public health concern around the world and predominates in Sub-Saharan Africa. Plasmodium falciparum is
responsible for the deadliest form of the disease. Much is being done to combat this fatal parasitic infection, and a proper understanding of human immune responses against the malaria parasite is of the essence. P. falciparum elicits both innate and adaptive immune responses in the infected individual. Adaptive immunity functions principally by the production of high affinity antibodies by plasma cells derived from primed B-cells. T-follicular helper (TFH) cells provide help for primed B-cells to differentiate into plasma cells and memory B cells in the germinal centers of secondary lymphoid follicles. The circulating counterparts of these TFH in peripheral blood, called circulating TFH (cTFH), seem to reflect the TFH dynamics that occur in germinal centers. Thus, cTFH may serve as peripheral surrogates of high affinity antibody response in malaria-experienced individuals, moreso because germinal centers are not readily accessible for routine sampling. cTFH could therefore be studied to better elucidate malaria immunity and pave the way for the development of vaccines and other
malaria control tools.
Our main objective was to quantify cTFH in the peripheral blood of malaria-experienced adults and investigate their relationship with high
affinity antibodies against P. falciparum. Specifically, we sought to: (1) Determine if cTFH expand during P. falciparum malaria; (2)
Explore the kinetics of cTFH during and after malaria infection; (3) Determine if cTFH levels correlate with antimalarial antibodies titers and
avidity.

In order to achieve these objectives, we carried out a research study of Cameroonian adults with ongoing or past malaria and with no other documented pathology. We also included 3 malaria-naïve Caucasian controls from the
United States of America (USA). Microscopy was used as gold standard for malaria diagnosis. Peripheral blood was collected and portions of it were cultured overnight with the malarial antigen MSP-1. Thereafter, peripheral
blood mononuclear cells (PBMC) were obtained from the cultured blood by density gradient centrifugation. CD4 T-cells were then sorted from the PBMC by magnetic negative selection and their total RNA extracted. Complementary
DNA (cDNA) synthesis and quantitative real-time PCR were successively performed on the extracted RNA. Identification and quantification of cTFH was based on the gene expression profiles of specific phenotypic markers such as CXCR5 and ICOS. Antibody studies were done on plasma samples using the Magpix Multiplex Analyte Platform (MAP) assay from Luminex® corporation. Data was entered in Microsoft Excel 2010 spreadsheets and analyzed using Graphpad Prism® 5.
We categorized our 30 participants as follows: 3 malaria-naïve controls, 6 malaria-experienced negative controls, 12 cases of ongoing malaria, and 9 paired convalescents who were the same individuals with ongoing malaria, but encountered two weeks after the disease. We found a statistically non-significant tendency with all malaria-naïve controls having CXCR5 expression (and therefore cTFH levels) below the set threshold of 6.408 (malaria-naive CXCR5 relative expression + 2 standard deviations), whereas 66.7% of experienced Cameroonian adults expressed CXCR5 levels above that threshold (p=0.25). Participants with ongoing malaria had lower CXCR5 expression during the acute phase of the disease compared to the convalescence period (p=0.0346). There was a positive correlation between CXCR5 expression and parasitaemia (r=0.911, p=0.0001). During in vitro culture, there was a tendency of higher CXCR5 in samples stimulated with MSP-1 compared to unstimulated samples. Also, malaria-experienced Cameroonians had significantly higher antibody titers than the
malaria-naïve controls (p=0.0057). Furthermore, expression of cTFH markers
seemed to relate (though not statistically significant) with anti-MSP-1 IgG both in terms of antibody titers (r=0.061, p=0.379) and antibody avidity (r=0.29, p=0.179).

In conclusion, our findings suggest that:
(1) P. falciparum malaria is associated with an expansion of cTFH in malaria-experienced Cameroonian adults.

(2) The kinetics of cTFH during and after the disease reveal that the effect of malaria on cTFH expansion is more pronounced outside the active phase of clinical disease.

(3) There is a likelihood of an association between cTFH abundance and anti-MSP1 IgG titers and avidity.

We therefore recommend that more research be done to:

- Evaluate the kinetics of cTFH in the long run with repeated malaria infections.

- Safely stimulate proliferation of cTFH in healthy individuals so as to attain acquired immunity against malaria.

- Ascertain these findings using larger sample sizes and other techniques.

Keywords: Circulating TFH, malaria, high affinity antibodies, immunity, kinetics, Plasmodium falciparum.

Résumé
Le paludisme demeure un problème majeur de santé publique et prédomine en Afrique Sub-Saharienne. Le Plasmodium falciparum est responsable de la forme la plus mortelle de la maladie. Afin de pouvoir combattre cette infection fatale, il est nécessaire d’avoir une bonne compréhension de la réponse immunitaire de l’homme face à ce parasite. La présence du P. falciparum stimule aussi bien l’immunité innée que l’immunité acquise de l’infecté. L’immunité acquise réagit principalement via la production des anticorps par des plasmocytes dérivés des cellules B. Les cellules T-auxiliaires folliculaires (TFH) fournissent de l’aide aux cellules B, afin qu’elles puissent se différencier en plasmocytes et en cellules B mémoire au niveau des centres germinatifs des follicules lymphoïdes. La portion circulante de ces cellules TFH, appelée cTFH, semble refléter la dynamique qui a lieu dans les tissus lymphoïdes. Ainsi, les cTFH pourraient servir de substitut des cellules TFH centrales étant donné que les organes lymphoïdes ne sont pas facilement accessibles. Les cTFH pourraient donc être étudiées afin de mieux comprendre l’immunité face au paludisme ; ceci pourrait aboutir à des meilleurs moyens de contrôle de cette maladie, voire un vaccin.
Notre but principal était d’apprécier le taux de cTFH dans le sang périphérique des adultes Camerounais sensibilisés au paludisme causé par le P. falciparum, et d’étudier la relation entre les cTFH et les anticorps à haute affinité contre P. falciparum. Plus spécifiquement, il était question pour nous de : 1) Déterminer si il y’a prolifération des cTFH lors du paludisme causé par le P. falciparum ; 2) Explorer la cinétique des cTFH pendant et après l’infection au P. falciparum. 3) Investiguer si les taux de cTFH corrèlent avec les taux d’anticorps ainsi qu’avec l’avidité de ces anticorps.
Afin d’atteindre ces objectifs, nous avons mené une étude de recherche portant sur des adultes Camerounais âgés de 18 ans au moins et faisant un paludisme à P. falciparum, sans autre pathologie documentée. Nous avons également inclus des témoins non-infectés venant du Cameroun et des Etats-Unis d’Amérique. L’examen microscopique a été utilisé comme référence pour le diagnostic. Nous avons collecté le sang périphérique des participants et nous l’avons mis en culture, tout en stimulant une partie avec l’antigène MSP-1 du P. falciparum. Par la suite, nous avons isolé les cellules CD4 du sang cultivé et leur ARN total a été extrait. Cet ARN a été converti en ADNc puis utilisé pour réaliser une PCR en temps réel, visant à mesurer l’expression génétique de certains marqueurs phénotypiques spécifiques aux cTFH tels que CXCR5 et ICOS. Les anticorps ont été étudiés par la technologie Multiplex Analyte Platform (Luminex® Corporation). Nous avons entré les données dans Microsoft Excel 2010 et nous les avons analysé à l’aide du logiciel Graphpad Prism® 5.
Nous avons catégorisé nos 30 participants comme suit : 3 témoins naïfs au P. falciparum, 6 témoins sensibilisés au P. falciparum, 12 cas de paludisme, et 9 de ces cas prélevés deux semaines plus tard (en période de convalescence). Nous avons trouvé une tendance avec tous les témoins naïfs ayant une expression de CXCR5 (et donc un taux de cTFH) inférieure au seuil de 6.408 (établi selon l’expression moyenne de CXCR5 des sujets naïfs + 2 déviations standards), tandis que 66,7% des adultes Camerounais sensibilisés avaient des taux de CXCR5 supérieurs au seuil (p=0.25). Les cas de paludisme actif avaient moins de cTFH que ces mêmes participants prélevés lors de leurs convalescences (p=0.00346). Il existait une corrélation positive entre le taux de CXCR5 et la parasitémie (r=0.911, p=0.0001). Lors de la culture in vitro, les cas stimulés avec le MSP-1 avaient tendance à avoir des taux de CXCR5 plus élevés par rapport aux cas non-stimulés. Les Camerounais sensibilisés au paludisme avaient des taux d’anticorps significativement plus élevés que les témoins naïfs (p=0.0057). En outre, le taux de cTFH démontrait une tendance d’association (bien que non-significative statistiquement) avec le taux d’IgG anti-MSP-1 (r=0.061, p=0.379) ainsi qu’avec l’avidité de ces anticorps (r=0.29, p=0.179).
En conclusion, nos résultats suggèrent que :
- Le paludisme à P. falciparum est associé à une prolifération des cTFH chez les adultes Camerounais sensibilisés.
- La cinétique des cTFH montre que l’effet du paludisme sur l’expansion des cTFH est plus marqué en dehors de la phase aigue de la maladie.
- Il est probable qu’il existe une association entre le taux de cTFH et le taux IgG anti-MSP1, ainsi qu’avec l’avidité de ces anticorps.
Ainsi, nous recommandons que d’avantages d’études soient réalisées afin de:
- Evaluer la cinétique des cTFH à long terme, avec des infections répétées à P. falciparum.
- Pouvoir stimuler sans risque la prolifération des cTFH chez des sujets sains afin de bâtir une immunité acquise contre le paludisme.
- Confirmer ces trouvailles avec une taille d’échantillon plus large et d’autres techniques.
Mots clés: TFH circulantes, paludisme, anticorps à haute affinité, immunité, cinétique, Plasmodium falciparum


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